間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，可在體外通過不同的方法干預(yù)下下誘導(dǎo)分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織，因其來源廣泛，分離無創(chuàng)傷，較低的免疫原性、生長周期短等特點，是組織工程種子細(xì)胞的重要來源。干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一方面是干細(xì)胞鑒定的主要方法，另一方面也是干細(xì)胞功能學(xué)研究的主要途徑。采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細(xì)胞。成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定。
實驗前準(zhǔn)備：
試劑：PBS，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，茜素紅
耗材：NEST細(xì)胞培養(yǎng)皿，NEST普通吸頭，NEST微量離心管
設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡
一、接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：
取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照2×105cells/cm2的細(xì)胞密度接種至包被后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)皿放到37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達60-70%時，棄掉上清，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。
二、細(xì)胞分化誘導(dǎo)：
每2-3天進行換液（定期觀察是否有污染），再放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2-3周，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時間，進行下一步染色鑒定。
三、細(xì)胞固定：
用吸頭（確保吸取充分）吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液細(xì)胞培養(yǎng)皿底面，室溫固30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。
四、茜素紅染色：
加入適量茜素紅染液染3-5min，吸去茜素紅染液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細(xì)胞干燥。
五、誘導(dǎo)評估：
顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進行圖像采集和誘導(dǎo)評估。誘導(dǎo)成功時，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)會與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。
圖c 間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化,茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)..
