干貨 | 皮下成瘤實(shí)驗(yàn)解析
手拿把掐教你使用基質(zhì)膠！
GelNest?基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。這些成分可以提供細(xì)胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號(hào)，同時(shí)也可以模擬生理環(huán)境中基底膜的特性，提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和效果。除了基底膜成分，GelNest?基質(zhì)膠中還富含多種生長(zhǎng)因子。這些生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖和遷移，從而進(jìn)一步模擬生理環(huán)境中的細(xì)胞信號(hào)通路和互動(dòng)。
GelNest?基質(zhì)膠具有廣泛的應(yīng)用前景，特別是在組織工程、細(xì)胞培養(yǎng)和研究等方面，可被用于類(lèi)器官培養(yǎng)、干細(xì)胞分化、血管生成、遷移或侵襲和體內(nèi)腫瘤發(fā)生等研究。
本文針對(duì)基質(zhì)膠在裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用方法進(jìn)行解析。
概述
皮下成瘤實(shí)驗(yàn)一般選用4-8周齡的小鼠。倫理學(xué)通常要求接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量不可超過(guò)1×107個(gè)/只。成瘤速度根據(jù)細(xì)胞的成瘤性、增殖速度、細(xì)胞接種量、小鼠品系等因素有所差異。藥物干預(yù)周期一般為0.5-2個(gè)月。
裸鼠是由于nu基因有獨(dú)特的遺傳特性，成為科學(xué)研究中具有巨大潛力的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＝?jīng)過(guò)世界各國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳育種學(xué)家的努力，已將nu基因?qū)氩煌幌祫?dòng)物，成為系列動(dòng)物模型，僅小鼠模型一種，已建立了二十余種近交系裸鼠。
常見(jiàn)成瘤細(xì)胞
較容易成瘤的細(xì)胞：
Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460(大細(xì)胞肺癌)， A431(表皮癌)，SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌）SKBR3， A375/B16-F10（人黑色素瘤細(xì)胞），SGC7901 人胃腫瘤細(xì)胞 ，KB人口腔表皮樣癌細(xì)胞
可以成瘤但是比較慢的細(xì)胞：
CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（結(jié)腸癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231 乳腺癌 ， CT26 （小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞 ），SH-SY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 ) ， U251 （人膠質(zhì)瘤細(xì)胞） ， BGC-823（人胃癌細(xì)胞） ，PC-3 （人前列腺癌細(xì)胞）
一些比較有爭(zhēng)議的細(xì)胞：
Hela（宮頸癌），HCT（人回盲腸癌細(xì)胞/人結(jié)直腸癌腺癌細(xì)胞）。
其他：
BMSC（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）
操作流程
（以Hep-G2細(xì)胞為例）
01
將Gelnest?基質(zhì)膠（高濃度）置于冰中并在4℃過(guò)夜融化，使用預(yù)冷的移液管或吸頭混合基質(zhì)膠至均勻狀態(tài)。
注：高濃度低因子基質(zhì)膠的成瘤更快。
02
細(xì)胞收集：準(zhǔn)備對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的、細(xì)胞密度達(dá)80-90%左右的Hep-G2細(xì)胞，于收集細(xì)胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓未脫離培養(yǎng)皿時(shí)，去除胰酶，加入無(wú)血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。收集的細(xì)胞懸液300×g離心5分鐘，PBS洗滌2次。PBS重懸細(xì)胞至終濃度為8×10^7個(gè)細(xì)胞/mL。將細(xì)胞置于冰上待用。
注：1.懸浮細(xì)胞直接收集細(xì)胞懸液，貼壁細(xì)胞用胰酶消化后收集細(xì)胞懸液。
2.收集的細(xì)胞宜在1小時(shí)內(nèi)接種完畢。
03
將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠在4℃環(huán)境下按照1:1的比例混勻，制備成終濃度為0.5×10^7-5×10^7個(gè)細(xì)胞/mL。
注：細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠混合液需置于冰上以減緩細(xì)胞凋亡并防止基質(zhì)膠凝固。
04
使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物電動(dòng)剃毛器對(duì)小鼠注射部位皮膚進(jìn)行脫毛，然后用酒精棉球進(jìn)行消毒。
消毒
05
用不帶針頭的1mL注射器將細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠混合液吸入注射器，再裝上針頭。
注：吸取混合液前可用注射器緩慢吹打以混勻細(xì)胞。
06
左手抓取固定裸鼠，于裸鼠左側(cè)腋窩處皮下注射，接種時(shí)，針頭在皮下進(jìn)針深一點(diǎn)，約1cm深，以減少注射后細(xì)胞懸液從針眼溢出。接種體積通常為100μL/只。
注：這一過(guò)程盡量在半小時(shí)內(nèi)完成，途中細(xì)胞懸液放在冰上以減緩細(xì)胞凋亡及防止出現(xiàn)凝膠現(xiàn)象。
排空入針口
接種
接種后觀察
07
將裸鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，約1-3周可觀察到較明顯的瘤塊，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在腫瘤體積不超過(guò)1000mm^3前對(duì)裸鼠進(jìn)行安樂(lè)死，取出腫瘤，拍照。
腫瘤測(cè)量
腫瘤活體熒光
常見(jiàn)問(wèn)題與解答
Q1：常見(jiàn)的荷瘤不成功可能的原因？
A：
（1）細(xì)胞的狀態(tài)是成瘤實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，所以細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)一定要好，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)80-90%左右密度為宜，收集細(xì)胞前一天晚上更換新鮮培養(yǎng)基。需加入基質(zhì)膠輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系；
（2）可能是小鼠周齡太大，一般選擇5-6周齡裸鼠，小于4周可能不耐受過(guò)早死亡，大于6周免疫力會(huì)增強(qiáng)，不易成瘤。
（3）可能是小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（NSG（包括NOG、NCG，B-NDG等）＞Nod-scid小鼠＞Nude裸鼠）。
（4）接種部位也是成瘤實(shí)驗(yàn)的重要因素。選擇血管豐富且易操作的部位接種，如腋下、腹股溝、側(cè)腹部及頸背部等部位，其中腋下中后部皮下較好，成瘤率高，比較推薦打腋下，一人操作很方便，后續(xù)量瘤子也很好操作。
Q2:腫瘤長(zhǎng)起來(lái)后又消失的原因？
A：腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，如果出現(xiàn)腫瘤塊先縮小，后變大的現(xiàn)象，很可能是由于炎癥反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收造成的。
繼續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞吸收之后是否經(jīng)過(guò)幾周還能長(zhǎng)出來(lái)，如若后續(xù)腫瘤依舊未長(zhǎng)出來(lái)，可考慮更換免疫缺陷程度更大的小鼠。
Q3：造成腫瘤均一性很差的原因？
A：首先，并不是所有的腫瘤都能夠長(zhǎng)得均一形態(tài)。腫瘤生長(zhǎng)不宜過(guò)大，一般直徑不超過(guò)15mm，體積不超過(guò)2000mm^3
其次，如果同一分組內(nèi)小鼠腫瘤體積差距很大，可能是由于小鼠的周齡及接種細(xì)胞量不一致造成的，建議重新接種。
Q4：是否可以應(yīng)用免疫抑制劑加速腫瘤生長(zhǎng)？
A：一般不建議加免疫抑制劑，有限考慮選擇免疫缺陷程度更高的小鼠品系。
一、質(zhì)量控制介紹
二、選用指南
三、儲(chǔ)存及操作注意事項(xiàng)
GelNest?基質(zhì)膠在分裝前可以保存于 -20℃冰箱。初次使用時(shí)，應(yīng)融化后按照單次用量分裝，并保存于 -80° C 冰箱，有效期 2 年。注意不要使用無(wú)霜冰箱儲(chǔ)存 GelNest?基質(zhì)膠。
GelNest?基質(zhì)膠在 4℃下呈液態(tài)，在 37℃時(shí)會(huì)形成凝膠態(tài)，在溫度高于 10°C 時(shí)就會(huì)開(kāi)始凝固成膠，請(qǐng)預(yù)冷移液吸頭并盡量在冰上操作。
